美国TIRF Labs基于光导的全内反射荧光显微镜 – lgTIRF

基于光导的全内反射荧光显微镜 – lgTIRF

（如客户配备倒置显微镜，可购买相关部件进行升级）

                                                         

lgTIRF 是一种新颖且强大的工具，可用于单分子检测、超分辨率方法、质膜研究、实时微阵列、TIRF 与 AFM 的结合、多光子、膜片钳单离子通道、介电泳、电化学发光以及其他需要在空间内激发荧光的应用。

• lgTIRF 具有激发路径，与发射通道自然独立

• lgTIRF 可实现优异的信号与背景比

• lgTIRF 可与干式、水式和油浸式物镜一起使用

• lgTIRF 是一款工厂校准的系统，非常适合多色 TIRF 实验

• lgTIRF 使用玻璃或二氧化硅盖玻片，或带有光学底部的培养皿

• lgTIRF 平台还实现了浅角荧光显微镜 (SAFM)

• lgTIRF 使用光纤耦合照明器，通过约 2 米的光纤电缆连接

• lgTIRF 提供可重复的衰减波强度

• lgTIRF 可与紫外线激发一起使用，这是物镜 TIRF 所不具备的

• lgTIRF 允许使用光阱精确控制穿透深度

• 安装/卸载 lgTIRF 以及在 TIRF、SAFM、微点激发、落射荧光、透射和其他方法之间切换无需时间。

本网页介绍了基于光导的全内反射荧光 (lgTIRF) 系统的原理和特点。lgTIRF 系统设计为倒置显微镜的附加配件，可重新配置为正置显微镜。激发光通过 2 米光纤电缆传送到 lgTIRF 单元。电缆的 FC-PC 出口连接到 lgTIRF 单元，入口连接到多色或单色照明器。

lgTIRF 是一种功能强大且用途广泛的分析工具，可在同一平台上实现 TIRF 效果、浅角荧光显微镜 (SAFM) 和微点激发 (MSE)。后一种方法 MSE 非常适合探测细胞器、单离子通道和其他尺寸从 1 到 100 微米的物体。TIRF 激发光发射器有三种版本，根据耦合光的几何形状而不同：(i) 从盖玻片末端；(ii) 从盖玻片顶部，以及 (iii) 从盖玻片底部。不同的光发射器用于 TIRFing 培养皿、矩形盖玻片和其他格式的标本基底。(i) 几何形状（从末端）有两种“风格”：固定式和移动式。前者固定在 K-Frame 不锈钢平台上，方便快速对准，后者可以在盖玻片周围移动并使用任何侧面将光耦合到盖玻片中。

TIRF 用于单分子检测 (SMD)、超分辨率显微镜和其他需要在空间中激发荧光的研究 [1-4]。在 SMD 中，空间限制对于最小化背景信号和获得足以检测单分子的对比度是必不可少的。lgTIRF 提供了卓越的空间限制 - 它仅激发样本的约 100 nm 层。相比之下，共焦方案会激发约 1,000 nm。在 TIRF 中，激发光的强度在表面最大，并随着距离呈指数衰减。只有位于 TIRF 表面且距离表面约 100 nm 的分子才会被激发并发出荧光；样本的大部分不会被激发，也不会发出荧光。TIRF 的表面选择性也非常适合细胞膜研究、生物分子相互作用分析和其他领域。特别是，TIRF 是“ ...... “这种方法特别适合对活细胞中的质膜及其相关细胞器和大分子进行成像。该方法甚至可以显示细胞产生的最小囊泡，并且可以对单个蛋白质分子的动态进行成像。”  [Steyer JA，Almers W.，参考文献 5]。

TIRF 效应可以通过不同的光学方案实现，包括基于棱镜、物镜和光导的几何结构。每种几何结构都有其 优点和局限性。基于棱镜的方案提供了最佳的信号与背景比 [1]，但难以与倒置显微镜上的开放式灌注室一起使用。基于物镜的方案收集最大量的发射荧光，但由于杂散光强度大 (~15%)，TIRF 效应会受到影响，杂散光会激发位于衰减波之外的标本主体中的荧光团。只有在物镜 TIRF 中，激发光才会穿过发射通道并产生大量杂散光。文献中已记录到，只有在物镜 TIRF 几何结构中，杂散光才会通过照亮主体标本而降低 TIRF 效应 [1-3]。基于光导的几何结构 (lgTIRF) 提供卓越的信噪比，非常适合多色 TIRF，包括用于单分子检测、细胞膜、实时微阵列和其他研究的 FRET。lgTIRF 可与干式、水浸式和油浸式物镜一起使用。它在一次实验中和两次实验之间提供可重现的衰减波强度。lgTIRF 可与紫外线激发一起使用，这是基于物镜的 TIRF 所不具备的功能。

上图 1 说明了原理，图 2 显示了 lgTIRF 系统的照片。该系统安装在 110x160mm K 框架上，这是电动 XY 平移台的标准配置。在图 2 中，K 框架嵌套在一个更大的 200x220mm 平台中，适用于手动 XY 平台。lgTIRF 系统的基本型号配备四个 TIRF 激发光发射器：两个侧端发射器、一个用于耦合来自顶面的光的移动发射器和一个移动发射器或底部入口。发射器的示意图如图 3-6 所示。侧端发射器 SEL-1 和 SEL-7 的两个版本在表面产生的 TIRF 区域的宽度上有所不同。SEL-1 产生一个窄带 - 宽度最多为 1 毫米。SEL-1 推荐用于单分子检测和其他需要高强度衰减波的应用。 SEL-7 发射器可产生宽度达 20 毫米的更宽的倏逝波带，非常适合需要测量打印在约 20×20 毫米区域上的整个微阵列的响应的实时微阵列应用（图 4a）。

图 5 显示了使用顶面移动光纤发射器耦合光的原理。后者可用于从盖玻片顶面的任何可用位置耦合 TIRF 激发。图 6 说明了从底面耦合。这种几何结构专为配备光学底部的 TIRFing 培养皿而设计。在这种情况下，光从培养皿的底部进入并经历多次反射，如图 6 所示。嵌入 K 型框架的光纤和盖玻片通过一滴浸油实现光学接触，这样培养皿就可以沿 XY 轴“漂浮”。  

图 7 和图 8 显示了可选的微点激发 (MSE) 移动探针。这些移动探针不提供 TIRF 效应。然而，它们已成为许多相关应用的便捷工具。特别是，这些探针非常适合在空间内激发活细胞器和其他感兴趣的物体，尺寸从 1 到 100 微米。图 8 中所示的探针是为单离子通道/单分子检测而开发的，用于在单分子水平上研究 TRPC 离子通道 [Asanov A 等人，Cell Calcium。2015 年 1 月；57(1)：1-13]。此探针可在有或没有电生理学的情况下使用。

卓越的信噪比。 从信噪比的角度来看，lgTIRF 接近棱镜 TIRF 几何结构。与 pTIRF 类似，lgTIRF 中的激发路径自然独立于发射通道。光从其一端进入 TIRF 光导并从另一端逸出。独立于发射通道的激发提供了卓越的信噪比，比物镜 TIRF 高出 3-4 个数量级。

lgTIRF 系统兼容干式、水浸式和油浸式物镜 ，因此可用于广泛的研究——从细胞器的 TIRF 成像到微阵列实时响应的并行检测以及一组细胞的 TIRF 观察。

lgTIRF 可与 玻璃或二氧化硅盖玻片一起用作 TIRF 光导。矩形或圆形盖玻片，安装有一次性或可重复使用的温控开放式灌注室和封闭式流动室，可作为 lgTIRF 的选项。如上所述，有几种 TIRF 激发光发射器：一个固定式和三个移动式。固定发射器从盖玻片的末端耦合激发光，如图 4 所示。三个移动发射器从盖玻片的末端、顶部和底部耦合光，如图 4、5 和 6 分别所示。后一种发射器非常适合使用配备光学底部的培养皿进行 TIRFing。

激发通道的硅光学元件 包括光纤电缆、准直器和激发光发射器的光学元件；它们由紫外硅制成。分别地，使用硅盖玻片允许使用 190-1000 nm 的激发波长（包括紫外）进行 TIRF 成像，这是物镜式 TIRF 所不具备的功能。

 交钥匙 TIRF 站。TIRF 实验室提供交钥匙 TIRF 装置的全套仪器、耗材和服务。这些仪器包括：uTIRF Cube – 终极 TIRF 交钥匙站、TIRF 配件，包括棱镜、光导和物镜 TIRF、荧光照明器、数字流体、电化学、介电泳、温度控制和其他配件，用于使用 TIRF 系统、滤光轮、XY 和 XYZ 电动载物台进行简单和复杂的实验，以及用于控制仪器的相应软件。使用电化学或介电泳控制不仅可以在显微镜下对细胞进行成像，还可以与细胞互动。我们提供各种化学改性和生物功能化的光导、TIRF 载玻片和盖玻片，用于细胞生物学研究。应用说明说明了我们的 TIRF 产品在单分子检测、细胞生物学、脂质筏和实时微阵列研究中的用途。  

可重复的 TIRF 测量。lgTIRF 是一种几何结构，其衰减波强度在一次实验内和不同实验之间可重复。为此，入射角是固定的。在不同激发波长之间切换不需要重新调整。可以通过光学陷阱改变穿透深度，光学陷阱会熄灭入射角较小的光。  

SAFM。lgTIRF 平台还实现了 浅角度荧光显微镜 (SAFM)  - 激发模式如图 9 所示。在 SAFM 模式下，一部分激发光沿表面以浅角度传播，并照亮距离表面 1-5 微米的荧光团。lgTIRF 配有微点激发 (MSE) 探针，如图 7 和 8 所示。在 MSE 模式下，使用膜片钳移液器作为光导，将激发光传输到移液器的 1 微米尖端。图 7 显示了配备直径 5-50 微米的微纤维的 MSE 版本，可选择性地激发细胞器或一组尺寸为 5-100 微米的离子通道。在 TIRF、SAFM 和 MSE 模式以及落射荧光、透射率和其他方法之间切换无需时间。欲了解更多信息，请参阅以下网址的应用说明和文章：www.tirf-labs.com/applications

Literature cited:
1. Ambrose W, Goodwin P, Nolan J. Single-molecule detection with TIRF: comparing signal-to-background  in different geometries. Cytometry 1999, 36(3), 224.
2.Brunstein M, Teremetz M, Hérault K, Tourain C, Oheim M. Eliminating unwanted far-field excitation in objective-type TIRF. Part I. Biophys J. 2014; 106(5): 1020.
3.Brunstein M, Hérault K, Oheim M. Eliminating unwanted far-field excitation in objective-type TIRF. Part II. Biophys J. 2014; 106(5): 1044.
4.Asanov A, Zepeda A, Vaca L.  Platform for Combined DNA and Protein Microarrays Based on TIRF. Sensors, 2012, 12, 1800.S
5.teyer JA, Almers W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001, 2(4), 268.